ПРОГРАМА IV ЛІТНЬОЇ ШКОЛИ «МОЛЕКУЛЯРНА МІКРОБІОЛОГІЯ І БІОТЕХНОЛОГІЯ»

Одеса, 4– 16 травня 2009 року 

Організатори

• Одеський національний університет ім. І.І.Мечникова МОН України
• Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України
• За підтримки Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського

Автономні генетичні елементи бактерій: бактеріофаги, плазміди і транспозони

Теоретичний курс (20 год)

Лекція  1

Молекулярна генетика і молекулярна мікробіологія. Сучасні наукові концепції в молекулярній мікробіології. Біологічний метроном. Теорія нейтральної еволюції. Адаптивні мутації. Прокаріотно-еукаріотна дихотомія. Сучасні схеми класифікації прокаріотних і еукаріотних мікроорганізмів та вірусів. Домени життя.

Лекція 2 і 3

Первинна послідовність геномів. Методи встановлення первинної послідовності - сіквенс. Бактеріальна геноміка. Топологія цілісних бактеріальних геномів. Ортологи і паралоги. Кластери ортологічних генів (СОG). Концепція «найменшого» геному.

Лекція  4

Автономні генетичні елементи бактерій. Інсерційні послідовності, транспозони, системи рестрікції-модифікації, плазміди, бактеріофаги, острівки і острови патогенності. Ієрархія і мобільність автономних генетичних елементів. Автономні генетичні елементи і виникнення нових патогенних бактерій.

Лекція  5

Бактеріальні віруси. Сучасна класифікація бактеріофагів. Фаги з хвостовими відростками – порядок Caudovirales. Помірні і вірулентні бактеріофаги. Стратегія розвитку каудовірусів. Віруси бактерій і архебактерій. Фаги ентеробактерій і молочнокислих бактерій. Фаготерапія.

Лекція  6

Геноміка профагів і островів патогенності. Фагова лізогенна конверсія. Фагові токсини. Концепція «моронів». Острови патогенності і система секреції III типу.

Лекція  7

Дефектні бактеріофаги і бактеріоцини. Роль в міжбактеріальному антагонізмі. Перспективи використання бактеріоцинів – типування бактерій, біоконтроль бактеріальних популяцій і терапія раку.

Лекція  8

Геноміка плазмід. Плазмідні детермінанти патогенності. Вектори на основі плазмід. Молекулярна генетика плазміди pTi – С58 Agrobacteriumtumifaciens. Трансгенні рослини.

Лекція  9

Бактеріальні транспозони, ІS-елементи, інтегрони і генетичні касети. Формування множинної антибіотикостійкості у бактерій. Концепція внутрішньогеномних перебудов – геномний інженірінг.

Лекція  10

Екологія бактеріальних вірусів. Поширення і роль в глобальних обмінах речовини. Нові методи в екології бактеріофагів. Світовий океан і віріопланктон.

Лекція 11

Поняття про кластерний аналіз. Вимірювання спорідненості об'єктів. Проблема адекватності мір спорідненості та характеристики спорідненості організмів.

Лекція 12

Методи кластерного аналізу. Алгоритми прямої класифікації. Визначення кластерів. Алгоритми розрахунку кластерного аналізу, які застосовуються у біології. Критерії якості класифікації.

Лекція 13

Поняття нумеричної таксономії. Ієрархічні алгоритми. Застосування кластерного аналізу в нумеричній таксономії і філогенії.

Практичний курс (60 год)

Лабораторне заняття 1

Фаги порядку Caudovirales. Бактеріофаги Escherichiacoli: Т7 (родина Podoviridae), лямбда (Syphoviridae), Р1 і Т4 (Myoviridae). Класифікація. Морфотипи, організація віріонів. Віріонна ДНК.

1. Титрування фагів. Фагові бляшки (плаки), їх зв`язок з морфотипом, розміром віріонів та природою вірусів.
2. Препаративне одержання фагових часток. Метод злитного лізису чутливої культури. Концентрування фагових часток методом ПЕГ-преципітації (процедура Ямамото).
3. Виділення віріонної ДНК. Правила роботи з ДНК.
4. Рестрикційний аналіз. Ідентифікація бактеріальних вірусів за рестрикційними патернами їх геномів.

Лабораторне заняття 2

Молекулярна генетика помірного коліфага Р1. Загальна і спеціалізована Р1-трансдукція генетичних маркерів. Плазмідний профаг. Фагова система рестрикції-модифікації ЕсоР.

1. Температурна індукція лізогена E. coli С600 [P1::Tn9 (Cmсts 100)].
2. Одержання та тестування Р1-лізогенів.
3. Плазмідні профілі лізогенів.
4. Обмеження продуктивного розвитку бактеріофага лямбда в клітинах   E. coli (Р1) за рахунок R/М системи ЕсоР1.
5. Лізогенізація фагом P1::Tn9 клітин Erwiniacarotovora.
6. Інкорпорація транспозона Tn9 в криптичну плазміду рСА25 E.carotovora.

Лабораторне заняття 3

Плазмідні профілі бактерій. Форма і розмір позахромосомних кільцевих ДНК.

1. Особливості виділення плазмід у грамнегативних бактерій із природних екологічних ніш. Лужний метод Kado і Liu.
2. Ізоляція плазмідного профага Р1 та плазмід ентеробактерій F, RP4, pCA25, рСА25::Tn9. Електрофоретичне розділення плазмідної ДНК. Залежність електрофоретичної рухливості ДНК від її розміру.

Лабораторне заняття 4

Транскон`югація і трансформація. Створення умов для горизонтального перенесення плазмід в бактеріальні клітини. Мобільність плазмід. Плазмідні вектори.

1. Транскон`югативні плазміди. Перенесення плазміди R68.45 із E. coliв E.carotovora. Селекція реципієнта і контрселекція донора. Частота транскон`югації.
2. Одержання кальцій-компетентних клітин. Одержання плазмідної ДНК.

Трансформація E. coli DH і JM109 голубими плазмідами pUC 18 і pBluescript. Частота трансформації.

1. Плазмідні профілі транскон`югантів та трансформантів.

Лабораторне заняття 5

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – синтез певного фрагменту ДНК invitro. Різновиди ПЛР. ПЛР-діагностика бактеріального раку винограду:  виявлення послідовностей Ті-плазміди патогенних штамів Agrobacteriumtumefaciens і Agrobacteriumvitis. Метод “біо-ПЛР” у діагностиці хвороб рослин. Правила роботи у ПЛР-лабораторії.

1. Виділення плазмідної ДНК методом теплового лізису бактеріальних клітин. Реакційні суміші для проведення ПЛР.
2. Ампліфікація послідовностей Ті-плазміди штамів Agrobacteriumtumefaciens і Agrobacteriumvitis. 
3. Електрофорез продуктів ПЛР.

Лабораторне заняття 6

Застосування кластерного аналізу при побудові родинних зв'язків. Побудова філограм за допомогою комп'ютерних програм.

1. Множинне вирівнювання як попередній етап при аналізі родинних зв'язків.
2. Знайомство з основними пакетами програм, які застосовуються у філогенії (програми on-line).
3. Знайомство з програмою з аналізу первинної послідовності і побудова на її основі філограм (пакет MatLab).

Укладач: зав. відділом молекулярної
біології бактеріофагів ІМВ НАНУ,
проф. кафедри мікробіології
та вірусології ОНУ, д.б.н.  
Товкач Ф.І.